Virkningen AV h63d mutasjoner, magnetisk resonans og metabolsk syndrom blant polikliniske henvisninger for forhøyet serum ferritin I Baskerland | Annals Of Hepatology

Innledning

SF verdier er ofte forespurt av klinikere.1 Forhøyede NIVÅER AV SF er et vanlig funn i rutinemessige laboratorietester. Slike pasienter henvises til en poliklinisk sykehus konsultasjon for testing FOR HF og genetisk hemokromatose.1-5 Forhøyede SF-nivåer kan være tilstede ved ulike kliniske tilstander, som inflammatoriske sykdommer, og spesielt ved nyre -, lever-og neoplastiske sykdommer. Hos pasienter med leversykdom er forhøyet serumferritin karakteristisk for arvelig hemokromatose, men kan også finnes hos pasienter med kronisk hepatitt C, alkoholisk eller ikke-alkoholisk steatohepatitt og ikke-alkoholisk fettleversykdom.3,6

Epidemiologiske studier på arvelig hemokromatose (HH) i Middelhavspopulasjoner har vist at forekomsten AV C282Y er lavere enn I Nordeuropeiske land,3,7 og AT H63D-mutasjonen er funnet blant 15-20% av den generelle befolkningen.3,8 I Baskerland er allelfrekvensen så høy som 30%.7

det er begrensede data i litteraturen om kliniske og fenotypiske egenskaper hos polikliniske pasienter henvist TIL HF.1 Nærmere Bestemt har det vært svært lite forskning på epidemiologiske faktorer, inkludert alkohol, viral hepatitt, fedme og metabolsk syndrom.

I Dag, for å avgjøre om (eller ikke) et individ har overbelastning av leverjern, er det et veldig nyttig radiologisk verktøy, nemlig måling AV LIC VED MR.9,10 når validert, med verdier som er sterkt korrelert med de som er bestemt biokjemisk og standardisert, ER LIC-verdier oppnådd VED MR like nyttige som de som er oppnådd ved leverbiopsi.9-11

målet med studien vår var å prospektivt analysere påfølgende pasienter henvist til poliklinikken på et videregående sykehus i Baskerland og å bestemme årsakene TIL HF, samt relevansen AV hfe-genmutasjoner og leverjernmåling VED MR i diagnosen.

Materiale Og Metoderpasienter

dette var en prospektiv studie med pasienter fra januar til desember 2010. Studien ble utført I Mendaro Hospital, Deba Valley, et sekundært sykehus I Den Baskiske Helsetjenesten (Osakidetza), med en total nedslagsfelt på 70.000 mennesker.

Inklusjonskriterier: påfølgende polikliniske pasienter henvist TIL HF (> 200 µ/L hos kvinner, > 300 µ/l hos menn), i henhold TIL WHO-kriteriene,1,3 av Deres fastlege var kvalifisert til å delta i studien forutsatt at de var 18 år eller eldre.

Eksklusjonskriterier: systemisk inflammasjon, infeksjoner og nyre-eller neoplastiske sykdommer (ekskludert ved kliniske, laboratorie-og radiologiske metoder).

Metoder

  • Radiologi.

    • a)

      MR. MR-bilder ble oppnådd med en 1.5-Tesla system (Philips Intera, Osatek, Donostia). MR-teknikken som ble brukt (SIR-metoden)var den som ble foreslått Av Alustiza, et al.10 da steatose er hyppig, utfører vi systematisk t1-vektet i fase og motsatt faseavbildning for å kaste bort leversteatose. Alle jernkvantifiseringssekvensene var ifasesekvenser for å være sikker på at fettet ikke forstyrret signalintensitetsmålinger.12 LIC beregnet av denne modellen har en høy korrelasjon med biokjemiske målinger, oppnådd ved atomspektrometri, i leverbiopsiprøver (r = 0,937).10 LIC ble ansett som: normal (µ

mol / g), jernoverbelastning (IO) (37-80 µ / g) og høy jernoverbelastning (HIO) (> 80 /miol/g).10 Vi har også studert tilstedeværelsen av leverfett. Steatosis ble klassifisert som fraværende eller tilstede.

  • b)

    Abdominal ultralyd. Steatose ble gradert ved ultralyd og klassifisert som fraværende eller tilstede.3

  • Laboratoriemålinger. SF, Fe og TSI ble hentet fra blodprøver tatt fastende fra alle pasientene inkludert. Alle ble funnet å ha forhøyede SF-verdier (> 300 hryvnias / L), hvor laboratoriets normalområde for SF er 15 til 200 µ / L hos kvinner og 30 til 300 hryvnias/l hos menn.1,3 områdene som ble ansett som normale For Fe og TSI var henholdsvis 50-145 µ/dl og 15-45%.

    serumverdiene AV ALT, AST, GGTP, alkalisk fosfatase, bilirrubin, albumin, glukose, kolesterol, HDL-kolesterol, triglyserider, etc., ble oppnådd fra de samme blodprøvene.

  • HFE-mutasjonsanalyse. DNA ble ekstrahert fra blodprøvene og HFE-genanalysen ble utført av multiplex sanntids PCR ved Hjelp Av LightCycler-teknologi (LC 1.0). Samtidig påvisning AV hfe C282Y, H63D og S65C mutasjoner ble utført i en enkelt kapillær ved HJELP AV LC-Red 640, LC-Red 705 og fluorescein-merket hybridisering sonder (Tibmolbiol, Berlin, Tyskland). Smelting kurve analyse ble brukt til å skille vill type og mutant alleler i hvert tilfelle.

    resultatene ble sammenlignet Med en kontrollgruppe av blodgivere fra Samme geografiske område, Guipuzcoa.7

  • definisjon av metabolsk syndrom (MS). Vi benyttet etablerte kriterier, 13 nemlig.

    • °

      midjeomkrets ≥ 94 cm hos menn; ≥ 80 cm hos kvinner, og to av følgende faktorer.

    • °

      Triglyserider ≥ 150 mg / dL eller behandling for denne dyslipidemien.

    • °

      HDL

    • °

      glukose ≥ 100 mg / dL eller type 2 diabetes.

    • °

      Hypertensjon: systolisk trykk ≥ 130 mmHg; diastolisk trykk ≥ 85 mmHg, eller behandling av arteriell hypertensjon.

    • °

      Overvekt eller fedme, hvor en kroppsmasseindeks (BMI) 25 og 30, fedme.6

  • informasjonen om type 2 diabetes og behandling for hypertensjon eller dyslipidemi ble samlet inn fra intervjuet med pasienten.

    • Alkoholforbruk. Tung drikking ble definert som forbruket av > 60 g / dag; 8,14 mens > 40 g/dag ble ansett som moderat alkoholforbruk. Informasjonen ble samlet inn fra intervjuet med pasienten.

    • Statistikk. SPSS 15.0 programvare (SSPS Inc., Chicago, IL, USA) ble brukt til å utføre de riktige statistiske analysene. Middelverdier med rekkevidde og standardavvik ble beregnet for kontinuerlige variabler og frekvenser og prosenter for kategoriske variabler.

      for å sammenligne HFE-mutasjonsfrekvens hos PASIENTER MED HF og kontrollgruppen brukte Vi chisquare-og Fishers eksakte tester på grunn av det lave antallet tilfeller. I alle analyser, en p

    • Etikk. Studien ble gjennomført i samsvar Med Helsinkideklarasjonen og med forståelse og samtykke fra pasientene. Studien ble godkjent av Mendaro Hospital Ethics Committee.

    Resultaterpasienter

    Totalt 132 pasienter som oppfylte utvalgskriteriene ble inkludert i studien. Det var en mannlig dominans på ca 4:1 (108 menn, 24 kvinner).

    Ikke alle resultatene var tilgjengelige for alle pasientene.

    Radiologi

    Abdominal ultralyd tyder på steatose hos 69/132 (52,3%) og normalt hos 44 (33,3%), med andre funn i de resterende tilfellene (14,4%).

    LIC ble oppnådd VED MR hos 79/132 pasienter. Gjennomsnittlig LIC var 36.04 µ / g (SD: 32.78, 5-210), 53 pasienter med normale konsentrasjoner (µ

    mol / g), 22 IO (37-80 µ/g) og 4 hio (> 80 µ/g), 50% med en predisponerende genotype. Det vil si at 33% av pasientene hadde IO og 5% HIO.

    Steatose VED MR ble studert hos 79/132 pasienter: steatose var tilstede hos 27 pasienter (34,17%) og 52 pasienter hadde ikke leversteatose (65,82%).

    Kliniske og Laboratoriedata

    de viktigste kliniske og laboratoriedata er presentert i tabell 1-3. Totalt ble 43/89 pasienter (48,31%) klassifisert som overvektige (BMI 25-229.9), 36/89 (40.44%) som overvektige (BMI ≥ 30), og 10/89 (11.23%) som normalt (

    Tabell 1.

    Kliniske baseline data, laboratoriedata og lever jernkonsentrasjon (LIC) resultater oppnådd ved magnetisk resonans imaging (MRI) av pasientene inkludert i studien.

    Gjennomsnittlig SD Område
    Alder (yr) (n:132) 54.42 13.47 23 – 83
    Vekt (kg) (n:89) 83.17 15.86 43 – 137
    Høyde (cm) (n:89) 175.28 55.21 146 – 191
    BMI (kg / m2) (n:89) 28.80 3.96 17 – 39
    Alkohol (g / dag) (n:121) 20.83 33.95 0 – 140
    Ferritin (ng / mL) (n:132) 579.54 296.57 206 – 1668
    Transferrinmetning ( % ) (n:132) 43.87 14.10 12 – 95
    fe (µ/dL) (n:132) 133.77 49.69 55 – 322
    ALAT (IE / L) (n:132) 55.61 47.22 12 – 371
    GOT (IE / L) (n:132) 41.01 35.33 4 – 230
    GGTP (IE / L) (n:132) 94.83 141.47 8 – 806
    Alkalisk fosfatase (IE / L) (n:132) 73.32 20.71 34 – 160
    Bilirubin (mg / dL) (n:132) 0.74 0.38 0.15 – 2.71
    Albumin (g / L) (n:132) 4.60 0.32 3.50 – 5.50
    LIC av MRI (µ / g) (n:79) 36.04 32.79 5 – 210

    n: antall pasienter for hver variabel.

    Tabell 2.

    Laboratoriedata og kliniske data for metabolsk syndrom.

    N: 97 Gjennomsnittlig SD Område
    Glukose (mg / dL) 106.95 25.03 73 – 272
    Kolesterol (mg / dL) 201.71 42.92 96 – 338
    HDL-LAP (mg / dL) 54.00 17.08 28 – 162
    Triglyserider (mg/dL) 151.75 93.71 40 – 477
    Systolisk blodtrykk (mmHg) 139.26 19.93 100 – 190
    Diastolisk blodtrykk (mmHg)) 81.19 11.03 50 – 105
    Midjeomkrets (cm) 100.06 11.70 63 – 132

    Tabell 3.

    HFE-genmutasjoner hos Baskiske pasienter fra studiegruppen og kontrollgruppen.7

    N:120 Study group Control group
    C282Y/C282Y 0 0
    C282Y/WT 6 8
    C282Y/H63D 6 4
    H63D/H63D 21 9
    H63D/WT 38 45
    WT/WT 47 43
    S65C/WT 2 5
    H63D/S65C 0 2

    andelen overvektige pasienter var høy, og VI studerte MR-funnene i denne gruppen: 16 av 36 overvektige pasienter ble studert MED MR for jern og steatose. Gjennomsnittlig LIC i gruppen var 34.68 µ / g (SD 27.72). Steatose var tilstede hos 8 av 16 undersøkte pasienter. Tre pasienter fra 8 uten steatose hadde en ultralyd som foreslo steatose, men det var ingen uoverensstemmelsessaker (ultralyd / MR) i steatosegruppen.

    alkoholdataene (121 pasienter) viste at 77 (63.6%) konsumert ingen og 22 konsumert ≥ 60 g alkohol / dag(18,1%). Ved bruk av en cut-off på > 40 g / dag ble 25,6% ansett som drikkere. Gjennomsnittlig forbruk var 20,83 g alkohol / dag (SD: 33,95, 0-140).

    Viral serologi ga positive resultater hos 6/132 pasienter( 4,5%): FOR HBV i 2 tilfeller (1,5%) og HB-sAg og HCV hos 4 (3%).

    totalt 50 pasienter fikk behandling for hypertensjon og 35 for dyslipidemi.

    MS (13) ble påvist hos 44/80 menn (55%) og 10/17 kvinner (59%), tilsvarende samlet til 54/97 AV HF-pasientene (55,67%).

    det ble ikke tatt leverbiopsier i studieperioden.

    HFE mutasjonsanalyse

    denne analysen ble utført hos 120 pasienter. Mutasjoner ble funnet i 60,84% av tilfellene i studiegruppen (vs. 62,93% av kontrollgruppen). Resultatene er presentert i tabell 3. Genotypefrekvensen TIL h63d / H63D-mutasjonen i tilfeller var mer enn dobbelt så høy som i kontroller (17,5 vs. 7,76%), mens allelfrekvensen TIL H63D-mutasjonen også var høyere: 36 vs. 31% kontroller.7 disse forskjellene var signifikante (p

    Predisponerende genotyper for overbelastning av jern i leveren/ HH8 ble funnet hos 27/120 pasienter (22,5%), H63D/ H63D i 21 OG C282Y/H63D i 6 tilfeller. Tjue pasienter hadde TS > 45%, OG LIC ble målt VED MR i alle tilfeller: I h63d/H63D-gruppen hadde 7 pasienter økt og 8 normale LIC-verdier, mens I c282y/H63D-gruppen ble en pasient funnet å ha økt og 3 normale LICs ved MR.

    HFE-mutasjonsanalyse i MS

    denne analysen ble studert hos 51 av 54 PASIENTER MED MS. resultatene var: 2 C282Y/wt (3,92%), 11 H63D / H63D (21.56%), 15 H63D /wt (29,41%), 3 C282Y / H63D (5,88), 19 wt/wt (37,25%) og 1 S65C (1,96%). Genotypefrekvensen FOR h63d / H63D-mutasjonen i MS-tilfeller var signifikant høyere enn i kontroller7 -21,56 vs. 7,76% – − p = 0,011); h63d-allelfrekvensen var 42,15% I MS-gruppen og 31% i kontroller (p = 0,027).

    HFE og lever jernoverskudd

    Tjueseks pasienter ble vist Å ha IO-HIO i leveren VED MR. BLANT disse individene fant HFE-mutasjonsanalysen: H63D / H63D i 8 tilfeller; wt/wt, 7; H63D/wt, 7; S65C/wt, 2; C282Y/wt, 1; og C282Y/H63D, 1; det vil si at 9 av disse 26 pasientene hadde predisponerende genotyper.

    da vi analyserte noen spesielle grupper, nemlig SF > 1000 ng / L-gruppen, og HIO-gruppen fikk vi følgende resultater:

    • sf > 1000 ng/L gruppe: 12/132 pasienter (9%) hadde SF nivåer på > 1000 ng/ L. i denne gruppen ble genotypene bestemt hos 11 pasienter med følgende resultater: H63D / wt i 5; wt/ wt, 3; H63D/ H63D, 1; C282Y/ wt, 1; OG S65C/wt, 1. Følgelig ser DET ut Til at DET ikke er noen sammenheng MELLOM HFE-genmutasjoner og SF > 1000 ng/L. VIDERE BLE LIC oppnådd VED MR i 10/12 av pasientene i gruppen med høy ferritin (> 1000 ng/L). LIC ble hevet (> 36 µ/ g), tilsvarende IO, hos 8/10 (80%) av disse pasientene, mens 2 hadde HIO.

    • HIO-gruppe: totalt hadde fire pasienter LICs på > 80 µ/g, og deres genetiske funn var: H63D/wt i 2; C282Y/H63D i 1; OG H63D / H63D i 1; det vil si at 50% av disse pasientene hadde predisponerende genotyper. C282y / H63D-pasienten spiste ikke alkohol og hadde verken steatose eller MS. En H63D pasient drukket mer enn 80 g alkohol / dag og presenterte steatose; mens den andre pasienten med H63D, drakk ingen alkohol og steatose ble ikke observert. TIL slutt drakk H63D/ H63D pasienten mer enn 80 g / dag, men hadde ikke steatose.

    Diskusjon

    HF er et hyppig funn i primærhelsetjenesten ved rutinemessige laboratoriestudier. Pasienter med forhøyet SF henvises til gastroenterologi-hepatologi-enheter for å studere relevansen av denne kliniske enheten.1-5, 15, 16 Nylig Har Adams Og Barton17 publisert en artikkel som sier at ikke mer enn 10% av DISSE HF-pasientene har overbelastning av leverjern. I en retrospektiv studie, Yenson, et al.5rapporterte en enda lavere rate på 5% AV LEVER IO I Kinesiske og Andre Asiatiske populasjoner I British Columbia, Canada. Flere studier har fokusert på å analysere årsakene til høy ELLER svært høy HF, 18-21, men svært få har undersøkt etiologien til pasienter henvist TIL HF.1-3,5,16

    Wong Og Adams, 1 i en retrospektiv serie på 119 pasienter, fant AT I ikke-c282y homozygoter med SF > 1000 ng/L, VAR IO fraværende hos 64% av pasientene. Ved å analysere denne situasjonen hos pasientene som ble inkludert i studien vår, ble 80% av de med forhøyet SF > 1000 ng/L (12 pasienter) funnet Å ha IO. Dever, et al.2vi så på kliniske diagrammer av pasienter med HF som ble henvist til EN IO-Klinikk i USA: 51% av pasientene ble diagnostisert MED HH. Resultatene av denne studien er imidlertid påvirket av de blandede egenskapene til de inkluderte fagene (ikke bare de som er referert TIL HF, men også noen med kjent HH og deres slektninger) og er derfor ikke nyttige for sammenligning med våre data. I Italia, Licata, et al.3 studerte tilstedeværelsen av hepatisk siderose i leverbiopsier hos 54 pasienter, og fant det i 17 (32%) tilfeller. Perez Aguilar, et al.15 I Valencia, Spania, studerte tilstedeværelsen av jern i leverbiopsier hos 14 pasienter med SF > 1000 ng/ L, men for denne serien ble det ikke rapportert kvantitative målinger. I vår studiegruppe ble så mange som 33% av pasientene funnet å ha leverjernoverskudd ved hjelp AV en validert METODE ved BRUK AV MR.9-11 og enda viktigere var det at totalt 5% av pasientene hadde høy jernoverskudd i leveren (> 80 µ 1 / g), i likhet med HH-pasienter.

    Wong, Et al.1 rapporterte at 71% av pasientene med forhøyet LIC hadde EN TSI > 50%. I vår serie hadde > 50% av pasientene økt TSI i IO-HIO-gruppen.

    i Baskerland er forekomsten AV HFE-genmutasjoner i HH og den generelle befolkningen forskjellig fra Andre populasjoner I Europa og andre steder over hele verden.7 I HH-gruppen hadde bare 57% av pasientene c282y / C282Y-mutasjonen, MENS H63D-mutasjonen er svært utbredt selv i den generelle befolkningen, med en frekvens > 30%.

    det er tegn PÅ at h63d-mutasjonen bidrar til jernoverskudd, øker serumjern og transferrin, og at forholdet til HH er uavhengig av TILSTEDEVÆRELSEN AV c282y-mutasjonen.8,21 i en kontrollgruppe var 7 h63d-allelfrekvensen 31%. I denne studien av pasienter referert TIL HF, presenterte 61% mutasjoner I hfe-genet, tilsvarende frekvensen i kontroller (63%). Allelfrekvensen var 36 vs. 31% i kontrollgruppen, og genotypefrekvensen FOR h63d/H63D-mutasjonen var 17,5%, sammenlignet med bare 7,75% i kontrollgruppen (begge p 22,23

    I En Tidligere studie Av Aguilar-Martinez, et al., 23 frekvensen AV h63d homozygot genotype ble funnet å være høyere blant pasienter som hadde blitt henvist med EN PERSONLIG ELLER familiehistorie MED IO enn i den generelle populasjonen. Den kausative rollen til h63d / H63D-mutasjonen i HH eller IO er vist,22-24, men med mindre penetrans og en betydelig variasjon i fenotypisk uttrykk.23 Ved Å Vurdere relevansen AV hfe-mutasjoner i våre hio-og IO-grupper, ble det ikke funnet signifikante forskjeller. Videre ble DET ikke sett NOEN HFE-genotypeforskjeller ved studier av sf > 1000 ng/L-gruppen.

    Kliniske studier tyder på at det er forskjeller i jernmetabolisme og leversykdommer mellom menn og kvinner.25 I Samsvar med dette var det i vår serie et mannlig / kvinnelig kjønnsforhold blant pasienter på 4:1. Virale årsaker (4.5%) ble ikke funnet å være signifikant som faktoren bak HF i vår gruppe, i motsetning til i andre populasjoner, som Asiater, hvor viral hepatitt er mer utbredt (17%) hos HF-pasienter.5 i andre studier har den virale prevalensen av hepatitt C-viruset variert fra 3 til 42,7%.1-3

    Pasienter med en historie med kronisk alkoholforbruk eller funksjoner AV MS ofte til stede med hyperferritinemi.6 Tung drikking (> 60 g / dag alkohol) ble påvist som årsak, 8, 13 i 18% av befolkningen studerte (25,6% hvis man vurderte en cut-off på > 40 g / dag). Overvekt (BMI: 25-29.9) og fedme (BMI > 30) fremstår imidlertid som de viktigste årsakene til denne enheten: 89% av pasientene var overvektige eller overvektige på TIDSPUNKTET FOR HF-diagnosen. De overvektige pasientene viste EN LIC ved MR på 34,68 µ/g, ikke forskjellig fra hele studiegruppen, og 50% viste fett i leveren, steatose. Videre viste lever ultralyd tegn på steatose, med mistanke om alkoholfri fettleversykdom, hos 52% av pasientene. Da VI studerte for tilstedeværelse av fett I leveren VED MR, var steatose tilstede hos 34,17% av de 79 studerte pasientene. MS er tilstede hos 25% av voksne I Vestlige land, OG HF er funnet hos bare 15% AV MS-pasientene.26-30 I en nylig studie for påvisning AV HH og biokjemisk jernoverbelastning i primærhelsetjenesten, utviklet I Spania, hadde 45% av pasientene med forhøyede jernmål (TSI og/eller SF) MS. 31 Spesielt i vår studie oppfylte 56% av pasientene MED HF kriteriene FOR MS. Med tanke På den høye prosentandelen H63D-mutasjon i befolkningen, har vi studert HFE-mutasjoner I MS-gruppen for å avgjøre om disse mutasjonene predisponerer FOR MS. h63d/H63D-mutasjonen i MS-tilfeller var signifikant høyere enn i kontroller7 -21.56 vs. 7,76%− (p = 0,011) og h63d allelisk frekvens var 42,15% I MS-gruppen og 31% i kontroller (p = 0,027). Disse resultatene peker på AT h63d / H63D genotype og H63D allel predisponerer pasientene med HF for å utvikle EN MS.

    Ved Å Analysere den høye SF-gruppen fant Vi ingen sammenheng MELLOM HFE-genmutasjoner og SF > 1000 ng/L. AV 12 pasienter med høy SF ble LIC bestemt AV MR i 10. LIC ble økt hos 8 av disse 10 pasientene( 80%), noe som indikerte AT DE hadde IO.

    Konklusjon

    til slutt kan VI si fra denne studien AT H63D/H63D genotypen predisponerer FOR HF. Fedme og overvekt er svært viktige etiologiske faktorer, som påvirker 89% av VÅRE HF-pasienter. I vår region kan alkohol være EN årsak TIL HF, men virus var sjeldne som en underliggende faktor. Ikke ALLE HF representerer jernoverbelastning6, MEN MR viste jernoverbelastning hos 33% av pasientene. MS er til stede hos 56% av pasientene og kan induseres AV h63d / H63D genotype OG H63D allel.

    Forkortelser

    • BMI: kroppsmasseindeks.

    • Fe: jern.

    • HF: hyperferritinemi.

    • hh: arvelig hemokromatose.

    • HIO: høy jernoverbelastning.

    • IO: jern overbelastning.

    • LIC: lever jern konsentrasjon.

    • MR: magnetisk resonansavbildning.

    • ms: metabolsk syndrom.

    • sf: ferritin.

    • TSI: transferrin metning.

    Interessekonflikter

    forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter. Forfatterne er ansvarlige for innholdet og skrivingen av papiret.

    Forfatterbidrag

    alle forfattere oppfylte kriteriene for forfatterskap som etablert av International Committee Of Medical Journal Editors. Manuskriptet representerer ærlig arbeid, og alle forfattere er i stand til å verifisere gyldigheten av de rapporterte resultatene.

    Kongress: presentert som abstrakt på Liver International meeting (EASL) 2012; Barcelona, Spania, April 18-22/ 2012.

    Anerkjennelse

    forfatterne takker oversettelsesavdelingen Til Instituto Vasco De Investigaciones Sanitarias (BIOEF) for deres hjelp.

    Legg igjen en kommentar

    Din e-postadresse vil ikke bli publisert.